En 1567 il se rend dans la capitale pour y devenir pharmacien. Il se joint à une association de jeunes s'engageant à une vie radicalement évangélique, dirigée par un père dominicain. Abandonnant la pharmacie il se met à l'étude de la théologie.

Ordonné prêtre en 1572, il se consacre à la formation chrétienne des jeunes dans sa paroisse de Lucques puis fonde une « Compagnie de la Doctrine chrétienne », dont le but est de faire passer par l'enseignement les prescriptions du concile de Trente dans la vie des paroisses. 

En 1574, cette communauté devient l'institut religieux des « Clercs réguliers de la Mère de Dieu ». Leur but est de travailler à l'approfondissement de la foi et de la dévotion.

Son esprit réformateur lui vaut des inimitiés, et il est expulsé de son pays, la République de Lucques. Mais il a le soutien du pape Clément VIII (Ippolito Aldobrandini, 1592-1605) qui l'invite à Rome pour y réformer plusieurs communautés religieuses. Avec ses clercs il travaille à répandre le culte marial, la dévotion aux quarante heures et la communion fréquente. Le sanctuaire de Sainte Marie in Portico leur est confié en 1601 et ils y font renaître le culte marial autour de l'ancienne et vénérable icône.

Le pape, qui l'estime pour ses qualités de fermeté et de discernement, l'emploie à diverses tâches délicates comme la réforme de la congrégation bénédictine de Montevergine. Jean Leonardi fonde ensuite avec Jean Vivès le séminaire de la Propaganda Fide (Propagation de la foi). 

Il passe de la terre au ciel le 09 octobre 1609 en se dévouant auprès de ses frères atteints de l'épidémie d'influenza qui sévissait alors à Rome. Il laisse à sa mort deux maisons de Clercs de la Mère de Dieu, une à Lucques et l'autre à Rome. Trois autres furent ouvertes au XVIIe siècle.

L'institut des « Clercs réguliers de la Mère de Dieu » recevra l'approbation pontificale en 1614. La règle définitive de sa communauté n'est publiée qu'en 1851. 

Giovanni Leonardi est béatifié en 1861 et canonisé en 1938. Sa dépouille repose dans l'église Sainte Marie in Portico de Rome. Liturgiquement il est commémoré le 9 octobre. 
Le 8 août 2006 le pape Benoît XVI l’a déclaré patron des pharmaciens.

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