À l'école, Thomas offrait son déjeuner aux enfants pauvres, et parfois il leur donnait ses propres vêtements pour les garantir du froid. On le vit revenir plus d'une fois à la maison sans gilet, sans chapeau et sans souliers. Ayant reçu un habit neuf à l'âge de sept ans, il le donna à un enfant à demi-nu. Il demandait souvent à sa mère la permission de ne pas dîner pour que sa part servît à un malheureux. Il employait l'argent qu'il recevait de ses parents à acheter des œufs qu'il portait aux malades hospitalisés.

Après de brillantes études à l'université d'Alcala, il fut nommé professeur de philosophie morale au collège de Saint-Ildefonse, puis professeur de théologie à l'université de Salamanque. Son père mourut peu de temps après et Thomas consacra toute sa fortune au soin des pauvres. Il transforma sa maison en hôpital, ne réservant que le nécessaire à l'entretien de sa mère. À trente ans, le jour de la Présentation de Notre-Dame, il entra chez les Ermites de St-Augustin de Salamanque. À peu près dans le même temps de son admission dans cet Ordre, Luther le quittait.

Thomas fut un prédicateur ardent. Son zèle remua de fond en comble la ville de Salamanque. Il puisait son éloquence au pied de la croix : « Dans l'oraison, disait-il, se forment les flèches dont les cœurs des auditeurs doivent être percés. » Les plus grandes villes d'Espagne se disputèrent pour l'entendre. La cour de Charles-Quint l'écouta avec admiration et le roi le nomma son prédicateur ordinaire et son conseiller. Il avait une si grande estime pour ce religieux qu'il ne savait rien lui refuser. Plusieurs seigneurs de la cour avaient été condamnés à mort pour crime de haute trahison. L'empereur avait refusé leur grâce à l'archevêque de Tolède ainsi qu'à d'autres éminents personnages, même à son propre fils, mais il accorda cette faveur à la demande de Thomas.

Le saint religieux devint successivement prieur des maisons de Salamanque, de Burgos, de Valladolid, provincial d'Andalousie et de Castille. C'est lui qui envoya les premiers Augustins vers le Mexique. Il recommandait surtout quatre choses à ses religieux : la célébration dévote et attentive des divins offices ; la méditation et la lecture spirituelle faite avec assiduité ; l'union de la charité fraternelle, et enfin la fuite de la paresse qui est un grand obstacle à la vertu. 

Nommé archevêque de Grenade, il refusa catégoriquement cette dignité.

Dix ans plus tard, en 1544, Charles-Quint le désigna pour l'évêché de Valence qu'il fut obligé d'accepter au nom de l'obéissance et sous peine d'excommunication. Thomas quitta sa cellule en pleurant, se mit en route à pied, revêtu d'un habit monastique fort usé et entra ainsi dans sa ville épiscopale. Au moment de son arrivée, la pluie tomba en abondance après une longue période de sécheresse, bienfaisante ondée qui était comme le présage des grâces qu'il apportait à ses ouailles. 

Le voyant si pauvre, ses chanoines lui firent présent de quatre mille ducats pour son ameublement mais Thomas de Villeneuve les fit distribuer en aumônes. Il entreprit la réforme de son diocèse par l'exemple de sa vie toute de pénitence et de prière. Pendant toute son existence, il observa les jeûnes de son Ordre et ceux de l'Église, au pain et à l'eau. Il couchait sur des sarments dissimulés sous une couverture de laine. La plus grande partie de ses revenus passait en bonnes œuvres. On l'a surnommé : l'Aumônier, à cause des charités incalculables qu'il ne cessait de prodiguer.

Trois jours avant sa mort, ce saint pasteur fit distribuer aux pauvres tout ce qui lui restait d'argent et fit don de ses meubles au collège de Valence. Comme il était encore propriétaire de son lit de malade, il le donna au geôlier de ses prisons, le priant de bien vouloir le lui prêter jusqu'à sa mort.

Thomas de Villeneuve commença la récitation du psaume : In Te, Domine, speravi. Rendu au verset : In manus Tuas, Domine, commendo spiritum meum, le saint pontife expira doucement. Il rendit son âme à Dieu dans la onzième année de son épiscopat, à l'âge de soixante-sept ans. Ses reliques sont conservées à Valence.